Descrição: O jogo se inicia logo depois dos eventos de Assassin´s Creed II, no ano de 1499, quando Monteriggioni (ou a Villa Auditore) é atacada pelo exército Borgia, comandado por Cesare Borgia. Durante a batalha, o tio de Ezio, Mario, é morto e a Maçã do Éden é roubada. O jogo então avança até o ano de 1503, onde Ezio Auditore, agora um Mestre Assassino, deve procurar, nas ruas de Roma, pelos assassinos de seu tio e recuperar a Maçã do Éden, peça fulcral para os Assassinos.